荧光显微镜买家指南

眼见为实，对于许多生物学家来说，他们想要看到的是通过显微镜观察荧光标签。荧光显微镜使得在细胞和亚细胞水平上可视化荧光蛋白或染料成为可能，已成为现代生物学的主力。

1852年，英国科学家乔治&midDOt;斯托克斯爵士**描述了荧光的概念，其中一个分子吸收一个波长的光，然后发出更长波长的光。但这种技术是以高分辨率设想这一过程并使用它的技术。自20世纪10年代德国物理学家设计早期荧光显微镜以来，为了照亮细胞过程已经走过了漫长的道路。科学家们在20世纪30年代开始使用荧光染料对组织进行染色，并于1942年开始使用荧光标记的抗体。1961年发现的水母绿色荧光蛋白有助于推动该领域的发展，因为它使科学家能够标记各种有荧光的蛋白质。 

在过去的几十年中，科学家已经开发了许多基于荧光显微镜的方法，不仅可以对分子的位置进行成像，还可以对它们如何移动和相互作 

购买荧光显微镜时，科学家有很多选择可供选择，在决定之前需要考虑很多因素。本买方指南讨论了仪器如何工作，它们可以用于什么以及在为您的研究需求选择系统时应该考虑什么。 

基础

降低到**基本的水平，荧光显微镜检查涉及照射具有某些波长的光谱的样品，然后检测发射的荧光团。所以这一切都始于光源。诀窍是平衡入射或激发光的强度。

它越强，从样品中获得的荧光就越多，或者发出的荧光就越多。但强烈的激发光也会损坏样品 - 甚**杀死活细胞或组织 - 或导致其中的荧光团“漂白”并随着时间变得变暗。

落射荧光显微镜

显微镜学家有三个主要选择：白色灯，LED或激光。弧光灯和LED照亮了所谓的落射荧光显微镜中的整个样品。灯是**常见的光源，含有汽化汞和放电白光等气体。然后，显微镜必须包括一个或多个滤光片，将光谱缩小到所需的波长 - 光谱的蓝绿色部分，例如，激发样品中的绿色荧光蛋白。这些显微镜一次将整个样品浸泡在光线下，因此可以将它们光漂白。在使用显微镜之前，灯泡需要一些时间进行预热，它们通常可以持续使用几百小时才会褪色并烧坏。当它们褪色时，它们提供不同的强度，使得难以精确地比较甚**几周之间进行的实验。

LED是另一种更新的选择，越来越受欢迎。在这种情况下，每个LED在光谱的有限部分产生光，因此与使用白光时相比，需要的滤波更少。与弧光灯相比，LED需要更少的功率，持续数千小时而不会褪色，并且不需要时间来预热或冷却。他们还立刻将整个样品洗净; 然而，它们通常不像灯泡那么强烈，因此导致光漂白的可能性较小。它们比灯便宜，价格在几美元左右。

来自光源的激发光从二向色镜反射，以将其引向样品。在那里它激发荧光团，然后发射出自己的更长波长。然后通过物镜收集该光，这放大了图像并且对于确定分辨率和图像质量是**关重要的。给定的物镜不仅具有给定的放大率（10倍，100倍等），而且还具有数值孔径的数量。数值孔径越高，所得图像的分辨率和亮度越高。一些物镜具有额外的透镜以**小化图像中的像差。

影响图像的另一个因素是光线在通往该物镜的途中经过的介质。 

如果光首先穿过空气，然后撞击物镜的玻璃，一些光将在该边界处散射，因为空气和玻璃具有不同的折射率。浸入介质（例如油）具有折射率以匹配物镜并使光散射**小化。

样品荧光团发出的光比激发光暗得多，激发光也被样品反射。这就是为什么将激发光反射到样品上的二向色镜是重要的。它允许发射光的波长在进入显微镜的过程中通过，但阻挡强激发波长。发射的光还通过发射滤光器，其仅选择所研究的荧光团的输出波长。这些激发和发射滤光片必须与您希望使用的任何荧光团相匹配。

然后信号可以传递到目镜，因此您可以查看样品。但当然，大多数科学家都希望记录他们所看到的内容。主要的相机选项是电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）或互补金属氧化物半导体（CMOS）。两者都是敏感的数码相机，可将入射光转换为电信号。EMCCD长期以来一直是标准，并且被认为更敏感，特别是在低光条件下，但CMOS相机正在改进。它们可以提供更快的图像采集，更大的视野和更好的分辨率。

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共聚焦显微镜

如落射荧光显微镜那样，用入射光击中整个样品意味着在所需视平面上方和下方的荧光团发光，限制分辨率。为了消除这一挑战，共聚焦显微镜  使用激光。使用镜子，他们可以将光线聚焦在一个点上，因此样品中其他地方的荧光团不会被激发。在发射端，还有一个带针孔的屏幕，用于将光从样品限制到所需的焦点。

在激光扫描共聚焦显微镜中，机器扫描平面上的激发光点，并提供比落射荧光通常提供的更清晰的图像。改变平面的水平导致在不同深度处的图像的“堆叠”，从而给出了样本的三维布置的概念。

激光扫描共聚焦显微镜只是共聚焦显微镜的一个版本。相比之下，旋转磁盘和可编程阵列显微镜可以激发来自激光或落射荧光源的激发光 - 通过多个针孔扫描图像。优点是这些系统可以更快地获得图像，这对于活细胞中的成像活动可能是**关重要的。然而，激光扫描共聚焦显微镜通常提供**高分辨率。

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像灯一样，激光在成像前需要一些预热时间，并且它们的强度**终会消失。但就像LED一样，激光持续很长时间，也许是几千小时。激光是**昂贵的光源，运行数千美元。

为了检测和放大弱发射光，共聚焦显微镜使用光电倍增管。入射光子首先击中光敏光电阴极，它吸收光子并发射电子。然后该电子与一系列电极相互作用，每个电极发射的电子多于它吸收的电子。结果是信号的放大。

表：荧光显微镜

应用

“现在几乎每个人都在使用荧光，” 伊利诺伊大学厄巴纳 - 香槟分校BECkman**科学与技术研究所的显微镜套件经理斯科特罗宾逊说  。“你想做的事情真的很广泛。”

“**重要的是蛋白质定位，” 威斯康星大学麦迪逊分校Newcomb成像中心的植物学家兼主任Sarah Swanson说  。“你可以将你的GFP附加到你**喜欢的感兴趣的蛋白质上，看看它在活细胞中的位置。”或者，通过将GFP连接到感兴趣的启动子，可以观察到表达水平如何随时间变化。

与荧光团连接的抗体也可以点亮感兴趣的蛋白质。同样，荧光标签可以帮助科学家看到细胞和细胞器等结构的形状。

虽然人们可以随时固定组织并观察它们，但活细胞成像也变得非常流行。研究人员可以随着时间的推移跟踪感兴趣的蛋白质或结构，使他们能够观察到稳态活动，或者看看当他们用药物或其他影响因素扰乱系统时会发生什么。

对于长期的实时成像，在温度控制和适当水平的氧气和二氧化碳的情况下，保持细胞在显微镜台上舒适的腔室是**关重要的。

显微镜也已进入高通量筛选应用领域，使用自动显微镜可以在科学家参与其他地方的过程中观察多个细胞。这使研究人员能够检查药物库或各种治疗是否会影响蛋白质的位置或活性并量化其结果。对于这些类型的实验，挑战变成处理和分析所有图像。

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共定位

因为光有这么多颜色，科学家可以看到同一样品中的多种蛋白质或染料，只要它们的激发和发射波长不同。这使得可以确定感兴趣的蛋白质或膜是否共同定位 - 表明它们居住在相同的空间中并且可以相互作用或不相互作用。

另一种观察样品中两种标记分子之间相互作用的方法是Förster共振能量转移（FRET）。当两个荧光团彼此在纳米范围内时，一个荧光团的发射可以激发另一个荧光团的荧光。“供体”荧光团的发射波长必须与“受体​​”的激发光谱重叠。因此，通过用显微镜光激发供体，人们应该能够观察受体的发射。通过这种方式，科学家们可以确定两个分子，甚**是同一蛋白质的两个部分，彼此靠近。

研究离子

蒙特利尔麦吉尔大学的寄生虫学家Petra Rohrbach表示，她的激光扫描共聚焦显微镜几乎是她所有实验的组成部分。她对疟疾寄生虫如何处理药物，将它们泵入寄生虫的酸性消化液泡以及使用活细胞成像来观察处理感兴趣。例如，她添加了荧光染料，寄生虫就像是一种有毒药物一样处理，她可以在显微镜下观察处理过程。

她还使用染料来指示钙的浓度，膜上的电位或pH值。例如，通过用荧光染料加载寄生虫，荧光染料随pH变化而变色，她可以监测消化液泡的酸度。如果其pH值向中性蔓延，则消化酶将无法发挥作用。罗尔巴赫说，杀死这种寄生虫可能部分是因为它无法消化其食物。

Swanson也在研究植物如何对压力源做出反应时使用离子敏感染料。例如，当植物弯曲并且机械应力时，钙水平会飙升。使用能够改变荧光，向下或不同颜色的染料 - 当被钙结合时，她可以观察活植物组织中发生的情况。遗传编码的离子指示器可以执行相同的功能。

激光技巧

某些共焦显微镜中的激光不仅仅是成像。研究人员还利用它们来评估他们所看到的分子是如何移动的。随着光漂白后的荧光恢复（FRAP），科学家们利用了太强的光可以破坏荧光团这一事实。他们在视野的一部分消灭荧光团，然后观察荧光何时返回。该区域的原始荧光团消失了，因此返回的荧光必须与从其他地方迁移的新荧光团有关。这使研究人员能够观察扩散或主动贩运的动态。

其变体是FLIP，其代表光漂白中的荧光损失。FLIP帮助科学家确定样品的哪些区域相互连接，并允许材料在它们之间扩散。研究人员反复光漂白一个斑点，一旦它们进入就会摧毁任何荧光团。在与该斑点相互连接的地方，整体荧光逐渐减弱。通过这种方式，生物学家可以确定区域的边界。

对于许多实验室来说，荧光成像是他们研究的生命线。“这是我们所做的一切，实际上，”  北卡罗来纳大学教堂山分校的Amy Gladfelter说  。她研究细胞质和质膜是如何组织的，并使用活细胞成像，FRAP和其他技术来了解蛋白质和细胞器如何排列和移动。她还使用先进的技术，专注于蛋白质在整个细胞中以及在细胞或体外的单个分子中移动的速度。

购物点

在试用潜在购买时需要检查很多东西。一个问题是易用性。显微镜可以并且确实带有许多铃声和口哨声，但当然这些功能仅在您需要它们的功能时才有用。那些有相当基本需求的人可能更喜欢细胞成像系统。这些简化的显微镜比传统的全功能显微镜小，易于使用，具有触摸屏界面。有些包括遮光罩，因此您无需在暗室中对细胞进行成像。这些对于与学生一起工作特别有利，他们不会被设备吓倒，并且可以专注于图像。

显微镜简单或花哨，科学家应该考虑他们需要什么样的成像模式。

除了多种颜色的荧光之外，研究人员通常希望通过相位对比成像来观察具有透射白光的细胞。罗尔巴赫说，确切地知道细胞的边界在哪里，这总是有用的。您可以使用的颜色数量 - 例如，显微镜可以与之连接的激光线数量 - 对于那些使用许多不同荧光团的人来说也是一个重要因素。

分辨率是一个需要考虑的关键特性，因为它决定了您能够区分哪些类型的特征。由显微镜和使用中的物镜决定的视场也很重要。例如，观察神经元的科学家可能需要足够大的视野来观察所有树突和轴突到达的位置，但研究细菌的研究人员可能会对较小的视野感到满意。Robinson补充道，另一种可能性是，某些显微镜软件可以自动将多个图像拼接在一起，从而创建来自几个小视野的大视图。

买家需要做的另一个选择是使用直立显微镜 - 其中物镜朝下放置在舞台上的样品 - 或倒置显微镜，其中物镜朝上。倒置系统通常用于研究培养细胞，因为细胞**宽的部分是接触培养皿表面。罗宾逊说，当然，如果样本很大 - 例如用于活体显微镜检查的动物 - 只有直立的样本。

您还需要决定是否要让目镜透过，或者只是想要样品的数字图像。Rohrbach指出，有些显微镜缺少目镜。

如果您无法立即负担所需的所有功能，请寻找可在实验室中更新的显微镜 - 例如，通过添加用于活细胞成像的培养箱--Robinson建议。同时，寻找在您所在地区拥有技术支持的公司，以便您在需要时快速获得帮助。

概要

虽然光学显微镜的基础 - 光子进入样品并在光学引导下返回 - 已有数百年历史，但荧光显微镜仍在不断发展。科学家和工程师正在开发更加灵活的方法来改进灵敏度和分辨率等功能。例如，超分辨率技术的出现意味着科学家们现在可以在不到200纳米的范围内区分细胞特征。

即使制造商使用**新的花哨更新他们的产品，他们也正在创建简化，价格合理的产品，帮助实验室访问荧光显微镜。那些只想观察一两种蛋白质的人可能能够使用方便的细胞成像系统。对于那些考虑更**应用的人 - 例如活细胞成像，FRAP或FRET显微镜（如共聚焦系统）提供了更多选择。

科学家在购买显微镜时有很多选择。问自己的关键问题是：“我将使用它来做什么？”这应该让您清楚地了解所需的功能。

编者注：我们要感谢并感谢Bio-Rad实验室全球产品经理VeronIKA Kortisova-Descamps女士对本文的深刻讨论和贡献。